定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí) 驗(yàn)方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板 進(jìn)行qPCR反應(yīng)。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原 體檢測(cè)、基因測(cè)試和疾病研究。
RT-qPCR的一步法與兩步法 RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成
（圖1、表1）。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與 DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中， 逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程是在兩個(gè)管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。
圖 1.一步法與兩步法RT-qPCR
表 1.一步法及兩步法RT-qPCR優(yōu)缺點(diǎn)比較
RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄過程
總RNA與mRNA的選擇
在設(shè)計(jì)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)過程中，決定是否要使用總RNA或純化的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄十分重要。盡管mRNA可能能夠 提供略高的靈敏度，但總RNA仍經(jīng)常使用。其原因是總RNA作為起始材料具有較mRNA更重要的優(yōu)勢(shì)。首先，其過程需要較 少的純化步驟，這確保了更好的定量回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù)。其次，其避免了mRNA富集步驟，這 能夠避免由于不同mRNA的回收率不同而帶來的結(jié)果偏移的可能性。總的來說，由于在大多數(shù)的應(yīng)用中，目標(biāo)基因的相對(duì)定 量比檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度更為重要，因此在大多數(shù)情況下，總RNA更適用1。
逆轉(zhuǎn)錄引物
在兩步法中，有三種不同的方法可用于引發(fā)cDNA反應(yīng)：oligo(dT) 引物、隨機(jī)引物、或序列特異性引物（圖2，表2）。通常 情況下，是將 oligo(dT) 引物和隨機(jī)引物進(jìn)行混合使用。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個(gè)用于合成的 起點(diǎn)位置。
圖 2.兩步法 RT-qPCR 中四種逆轉(zhuǎn)錄引發(fā)方法。
表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事項(xiàng)。結(jié)合使用隨機(jī)引物與錨定 oligo(dT) 引物可提高逆轉(zhuǎn)錄效率及 qPCR 的靈 敏度。
逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶 是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶。一部分逆轉(zhuǎn)錄酶具有 RNA 酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆 轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。對(duì)于 RT-qPCR 來說，理想的情況下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA，同時(shí)保持其在整個(gè)反應(yīng)過程中的全部活 性，從而得到更高的 cDNA 產(chǎn)量。
逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性
RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成。然而，當(dāng)使用長(zhǎng) mRNA 作為模板， RNA 可能被過早的降解，從而導(dǎo)致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆過程中，如果需要合成長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物時(shí)，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的。與此相反，擁有 RNase H 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶通常有利于 qPCR 的應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兡軌蛟?PCR 的第一個(gè)循環(huán)中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解（圖3）。
圖 3.逆轉(zhuǎn)錄酶中 RNase H 活性。
在 qPCR 中，使用具有 RNA 酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。
RT-qPCR 的 qPCR 過程
引物設(shè)計(jì)
用于 RT-qPCR 中 qPCR 步驟的 PCR 引物最好應(yīng)設(shè)計(jì)成跨越一個(gè)外顯子-外顯子連接，其中一條擴(kuò)增引物可以潛在地跨越實(shí) 際外顯子-內(nèi)含子邊界（圖4）。由于含內(nèi)含子的基因組 DNA 序列不會(huì)被擴(kuò)增，因此這種設(shè)計(jì)可以減少?gòu)奈廴镜幕蚪MDNA 中擴(kuò)增得到的假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。 如果引物不能被設(shè)計(jì)成能夠分離外顯子或外顯子-外顯子邊界，則有必要利用無 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶處理 RNA 樣品以除去基因組 DNA 污染。 RT-qPCR 對(duì)照 一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照（-RT對(duì)照）應(yīng)該包括在所有的 RT-qPCR 的實(shí)驗(yàn)中，以檢測(cè) DNA 污染（如基因組 DNA 或來自之前反 應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物）。這一對(duì)照包含除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有反應(yīng)組分。由于該對(duì)照不會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄，因此如果觀察到 PCR 擴(kuò) 增，則極有可能來自 DNA 的污染。
圖 4.RT-qPCR 中 qPCR 步驟的引物設(shè)計(jì)。
1）如果一個(gè)引物被設(shè)計(jì)為跨越外顯子-內(nèi)含子邊界，則可能造成污染的基因組 DNA 將不會(huì)被擴(kuò)增，其原因是引物不能退火至該基因組 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何內(nèi)含子，能夠有效被引物識(shí)別并 擴(kuò)增。
2）當(dāng)引物側(cè)接一個(gè)長(zhǎng)的內(nèi)含子（例如1 kb），擴(kuò)增反應(yīng)將不會(huì)發(fā)生，因?yàn)槎痰难由鞎r(shí)間僅夠用于擴(kuò)增短的 cDNA， 卻不足以擴(kuò)增基因組靶基因。
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