在同一組織細胞標本上需要同時檢測兩種抗原時，需進行雙重熒光染色。雙重免疫熒光標記法(double immunofluorescence labeling method)也分為直接法和間接法。 

標本要求：

切片、爬片 

冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟 

1、冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫，晾干水分，冷B酮固定10min，待B酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脫色 搖床上晃動洗滌3次，每次5min。 

2、修復：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。 3、 破膜：切片稍甩干后在圈內滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上 晃動洗滌3次，每次5min。 

3、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn) 用），加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內加少量水保持濕度。 

4、BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室 溫封閉30min。 

5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少 量水防止抗體蒸發(fā)） 

6、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬 的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。 

7、DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育 10min。 

8、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 

10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光 激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm） 

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實驗步驟

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯I15-20min-二甲苯II15-20min-無水乙醇I10min-無水乙醇II10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗(冬天脫蠟時間稍微延長)。

2、 修復:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止液體流走)，在圈內滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K儲存液用 PBS 1:9稀釋)覆蓋  組織，37度溫箱解育30min，將玻片置干PBS(PH7.4)中在脫色搖床上異動洗滌3次，每次5min

3、破膜:切片稍甩干后在圓內滴加破膜工作液要蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4. 加試劑1.2:按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內要蓋組織。切片平放干混盒內，37°C恒濕箱解音2小時，混盒內加少墨水保持溫度。

5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室 溫封閉30min

6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少 量水防止抗體蒸發(fā)） 

7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬 的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。 

8、 DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育 10min。 

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。 10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光 激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm） 

注意事項 

1、熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。 

2、每次試驗均需設置以下三種對照： 

(1)陽性對照：陽性血清+熒光標記物; 

(2)陰性對照：陰性血清+熒光標記物; 

(3)熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。

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