體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境，該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同于傳統的二維單層細胞培養，三維干細胞培養技術(three-dimensional cell culture，TDCC，簡稱3D培養)是指通過細胞聚集建立細胞球或將細胞嵌入支架上或支架內來模擬真實生物體組織的ECM（細胞外基質），進而在一定程度上模擬體內微環境。3D培養技術既能保留體內細胞微環境的物質及結構基礎，又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢。
3D細胞培養技術很多，但總結起來主要可分為3類：
1.3D水凝膠
水凝膠是水膨脹性的高分子網絡，被設計用來模擬復雜的細胞外微環境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細胞培養的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM聚合物。
舉例：ECM凝膠 從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營養，與細胞的發育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的 (蛋白質濃度:8–12mg/ml)。
在BME中培養16天后，對MCF-10A細胞進行染色：
A）細胞染色試劑盒（結構）；
B）細胞核；
C）線粒體膜電位； BME中培養12天后，對PC-3細胞進行染色：
D）Calcein AM（細胞活力）；
E）CPA染料1（細胞核）；
F）線粒體膜電位
2.細胞聚集
基于細胞聚集的方法不需要額外添加細胞外基質蛋白，細胞會產生內源的細胞外基質蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細胞數量、孵育時間和細胞增殖率等因素。
舉例：懸滴培養板
3D懸滴培養平板的孔板經過特殊設計，當在小孔上方加入一滴細胞懸液時，孔板的幾何構造就會引導細胞和培養基通過一個小洞，進而形成一個穩定的懸滴。滴入口位于每個培養孔的上方，可用來更換培養基，添加外源胞外基質、生長因子、小分子，也可用來加入細胞形成混合培養物。
3.培養支架
基本原理：支架可提供一種物理支撐，細胞可以進入支架生長和行使功能。孔隙分布、暴露平面區域和孔隙度具有關鍵作用，其數量和分布會影響細胞滲透入支架的效率，而依據不同的制作工藝，支架具有不同的結構、隨機或定制的孔隙分布。
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