體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維單層細(xì)胞培養(yǎng)，三維干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture，TDCC，簡稱3D培養(yǎng))是指通過細(xì)胞聚集建立細(xì)胞球或?qū)⒓?xì)胞嵌入支架上或支架內(nèi)來模擬真實(shí)生物體組織的ECM（細(xì)胞外基質(zhì)），進(jìn)而在一定程度上模擬體內(nèi)微環(huán)境。3D培養(yǎng)技術(shù)既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。
3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)很多，但總結(jié)起來主要可分為3類：
1.3D水凝膠
水凝膠是水膨脹性的高分子網(wǎng)絡(luò)，被設(shè)計用來模擬復(fù)雜的細(xì)胞外微環(huán)境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的ECM聚合物。
舉例：ECM凝膠 從小鼠肉瘤細(xì)胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營養(yǎng)，與細(xì)胞的發(fā)育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40°C熱激活，凝膠化過程也是可逆的 (蛋白質(zhì)濃度:8–12mg/ml)。
在BME中培養(yǎng)16天后，對MCF-10A細(xì)胞進(jìn)行染色：
A）細(xì)胞染色試劑盒（結(jié)構(gòu)）；
B）細(xì)胞核；
C）線粒體膜電位； BME中培養(yǎng)12天后，對PC-3細(xì)胞進(jìn)行染色：
D）Calcein AM（細(xì)胞活力）；
E）CPA染料1（細(xì)胞核）；
F）線粒體膜電位
2.細(xì)胞聚集
基于細(xì)胞聚集的方法不需要額外添加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，細(xì)胞會產(chǎn)生內(nèi)源的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細(xì)胞數(shù)量、孵育時間和細(xì)胞增殖率等因素。
舉例：懸滴培養(yǎng)板
3D懸滴培養(yǎng)平板的孔板經(jīng)過特殊設(shè)計，當(dāng)在小孔上方加入一滴細(xì)胞懸液時，孔板的幾何構(gòu)造就會引導(dǎo)細(xì)胞和培養(yǎng)基通過一個小洞，進(jìn)而形成一個穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個培養(yǎng)孔的上方，可用來更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長因子、小分子，也可用來加入細(xì)胞形成混合培養(yǎng)物。
3.培養(yǎng)支架
基本原理：支架可提供一種物理支撐，細(xì)胞可以進(jìn)入支架生長和行使功能。孔隙分布、暴露平面區(qū)域和孔隙度具有關(guān)鍵作用，其數(shù)量和分布會影響細(xì)胞滲透入支架的效率，而依據(jù)不同的制作工藝，支架具有不同的結(jié)構(gòu)、隨機(jī)或定制的孔隙分布。
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